http://ndte.energo.ru/rus/seminar/1999/t1.htm
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА В МОЧЕ:
ВОЗМОЖНОСТИ И ПЕРСПЕКТИВЫ
А.В
. Козлов, В.В. СлепышеваСанкт-Петербург, Россия
Корректное количественное определение белка в моче в ряде случаев является непростой задачей. Трудности её решения определяются следующим рядом факторов.
• низким содержанием белка в моче здорового человека, часто находящимся на пороге чувствительности большинства известных методов.
• присутствием в моче множества соединений, способных вмешиваться в ход химических реакций.
• значительными колебаниями содержания и состава белков мочи при различных заболеваниях, затрудняющими выбор адекватного калибровочного материала.
В клинических лабораториях преимущественно применяются так называемые “рутинные” методы определения белка в моче, однако они далеко не всегда позволяют получать удовлетворительные результаты
[Chambers, et. al, 1989].С точки зрения специалиста-аналитика, работающего в лаборатории, метод, предназначенный для количественного определения белка в моче, должен отвечать следующим требованиям:
1. Обладать линейной зависимостью между поглощением образовавшегося в ходе химической реакции комплекса и содержанием белка в пробе в широком диапазоне концентраций, позволяя тем самым избежать дополнительных операций при подготовке пробы к исследованию.
2. Результат определения не должен зависеть от белкового состава исследуемого образца мочи.
3. Должен быть прост, не требовать высокой квалификации исполнителя, выполняться при малом количестве операций.
4. Обладать высокой чувствительностью, аналитической надежностью при использовании небольших объёмов исследуемого материала.
5. Быть устойчивым к воздействию различных факторов (колебаниям состава образца, присутствию лекарственных препаратов и др.).
6. Обладать приемлемой стоимостью.
7. Быть легко адаптируемым к автоанализаторам
.К сожалению, ни один из известных к настоящему времени методов не может в полной мере претендовать на роль “золотого” стандарта.
Методы количественного определения содержания белка в моче могут быть условно разделены на три группы: турбидиметрические, связывания с красителями и химические [
Koller, 1984]. Из-за относительной простоты и достаточно высокой чувствительности наибольшее распространение получили турбидиметрические методы. Они основаны на снижении растворимости белков мочи вследствие образования суспензии взвешенных частиц под воздействием преципитирующих агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния, определяемого числом светорассеивающих частиц (нефелометр ический метод анализа), либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (собственно турбидиметрический метод анализа).Величина светорассеяния в преципитационных методах обнаружения белка в моче зависит от многих факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения рН среды, присутствия посторонних соединений, а также способа фотометрии. Для получения воспроизводимых результатов необходимо тщательное соблюдение условий реакции, способствующее образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц.
Чувствительность и специфичность наиболее широко распространенных турбидиметрических методов определяется выбором денатурирующего агента — сульфосалициловой (ССК) или трихлоруксусной (ТХУК) кислоты. По общему мнению, использование ССК обеспечивает методу более высокую чувствительность по сравнению с применением ТХУК. При этом температура реакционной среды не оказывает существенного воздействия на результаты исследования
. В то же время под воздействием ССК светорассеивающая способность частиц, образующихся из альбумина, в четыре раза превосходит светорассеяние частицами, образующимися в тех же условиях из глобулинов. При использовании ТХУК изменение соотношения между альбуминами и глобули-нами не сказывается на светорассеянии частиц, образующихся после воздействия ТХУК на образец мочи только в узком интервале температур от 20 до 25°С. При температуре от 25 до 50°С, более высока светорассеивающая способность частиц образующихся из альбумина [Schriever & Gambbo, 19 65].Некоторые лекарственные препараты влияют на результаты турбидиметрических методов определения белка в моче, приводя к так называемым “ложноположительным”, либо “ложноотрицательным” результатам. К ним относятся различные антибиотики (бензилпенициллин, клоксацилин и др.), иодсодержащие рентгеноконтрастные вещества, сульфаниламидные препараты.
Описан простой в исполнении турбидиметрический метод, в котором в качестве преципитирующего агента выступает детергент — бензе-тоний хлорид
(Benzethonium chloride). В отличие от других “преципитационных” методов при его применении реакция образования стойкой суспензии протекает в щелочной среде. По своей чувствительности данный метод приближается к биуретовому, а результаты определения мало зависит от соотношения между альбумином и глобулинами [Iwata & Nichikase О., 1979]. Метод адаптирован к автоанализатору [Van Straalen J.P.. et al.,1995].Во многих клинических лабораториях широкое распространение получили методы определения белка, основанные на способности различных красителей образовывать комплексы с белками. Наиболее популярными оказались следующие красители: Понсо
S (Ponceau S), Кумасси бриллиантовый синий (Coomassie Brilliant Blue) и Пирогаллоловый красный (Pyrogallol Red).Использование Понсо S в комбинации с осаждением белков ТХУК позволило разработать высокочувствительный метод оценки протеину-рии
[Pesce & Strande, 1973]. Различные белки мочи — глобулины и альбумин — выявляются этим методом со сравнимой чувствительностью. Метод характеризуется высокой воспроизводимостью, для исследования требуется небольшой объём образца мочи — в пределах 50 мкл. Получаемые данные хорошо коррелируют с результатами биуретового метода. но ниже по сравнению с турбидиметрическим методом, в котором ТХУК была использована в качестве преципитирующего агента [Dilena. etal., 1983].Краситель Кумасси бриллиантовый синий (КБС) способен связываться с положительно заряженными аминогруппами аминокислот, входящих в состав белковой молекулы, с образованием комплекса с максимумом поглощения при 595 нм (максимум поглощения красителя — 465 нм). Образование комплекса заканчивается через 2 мин. после добавления КБС в среду, его окраска стабильна в течение часа. Комплекс белок-краситель обладает высоким поглощением, что обеспечивает методу высокую чувствительность и требует для исследования небольшого объёма образца. Метод прост в исполнении и легко адаптируется к автоанализаторам
[Joem & Shcmoel, 1981]. Описано несколько вариантов его ручного выполнения [McEldery et al., 1982]. Различные белки обладают неодинаковой способностью связывать КБС. Если поглощение комплекса КБС-альбумин принять за 100%, то для гемоглобина и транс-феррина оно оказывается таким же. Однако, в этих же условиях величина поглощения глобулина, kappa - и liambda -цепей иммуноглобулинов составляет только 60% [Ramakers, 1984].Связывание в кислой среде (рН=2,5) белками комплекса краситель Пирогаллоловый-красный-ионы молибдена сдвигает максимум поглощения с 400 нм до 600 нм, что позволяет проводить количественное определение белка в моче в широком диапазоне концентраций. При температуре 37°С длительность реакции между белком и красителем составляет 10 мин. Образующийся комплекс устойчив к воздействию многих соединений, в том числе лекарственных препаратов, солей, оснований, кислот. Поглощение комплекса глобулины-краситель составляет 70% от величины поглощения комплекса альбумин-краситель, для легких цепей иммуноглобулинов эта величина колеблется от 52% до 68%
[Watanabe, 1986]. Метод пригоден для использования в автоанализаторе [Lynch, et al., 1996].Определение белка в моче биуретовым методом в настоящее время стало необоснованно редко использоваться в клинических лабораториях. В основе биуретовой реакции лежит взаимодействие ионов меди с пептидными связями в молекуле белка в присутствии сильного основания. Интенсивность пурпурно-фиолетовой окраски образующегося комплекса зависит от концентрации белка и может быть оценена абсорбциометрическими методами. Биуретовая реакция не обладает достаточной чувствительностью для определения содержания минимальных количеств белка в моче здорового человека. В связи с этим она чаше всего используется для количественного определения белка в моче после его концентрирования путём осаждения. Применяемые для этой цели реагенты обладают различной осаждающей способностью. В частности, ССК способна помимо белков осаждать значительную часть полипептидов, а более полному осаждению из мочи гликопротеидов способствуют хлорная кислота и реактив Цушия (этанол
; вольфрамовая кислота; соляная кислота) [Saifer & Gersenfeld. 1964; Mazzuchi, et al., 1974].Сочетание осаждения белков реактивом Цушия и их определение биуретовой реакцией позволяет довести чувствительность метода до 5 мг/л
[Mazzuchi, et al., 1974]. Некоторые компоненты мочи способны влиять на формирование биуретового комплекса. Их удаление из исследуемых образцов мочи с помощью гельфильтации с использованием Сефадекса G-50 позволяет проводить биуретовую реакцию в оптимальных для нее условиях, исключив вмешательство этих компонентов в ход реакции [Doetsch & Gadsden, 1975].Метод Лоури, обладающий более высокой чувствительностью по сравнению с биуретовым методом, сочетает биуретовую реакцию и реакцию Фолина на аминокислоты тирозин и триптофан в составе белковой молекулы. Несмотря на высокую чувствительность, он не всегда обеспечивает получение надежных результатов при определении белка в моче. Причиной тому служит неспецифическое взаимодействие реактива Фолина с не белковыми компонентами мочи (чаще всего аминокислотами, мочевой кислотой, углеводами). Отделение этих и других компонентов мочи путём диализа или осаждения белков позволяет с успехом использовать данный метод для количественного определения белка в моче
[Saifer & Gersenftid, 1965]. Некоторые лекарственные препараты — салицилаты, хлорпромазин, тетрациклины способны оказывать влияние на ход реакций и извращать результаты исследования.В основе еще одной группы количественных методов определения белка в моче лежит так называемая “белковая ошибка индикатора”, обусловленная способностью белковых растворов изменять цвет раствора индикатора при их смешивании. В растворе со значением рН<5 индикатор бромфеноловый синий (БФС) находится преимущественно в кати-онной форме, обладающей желтой окраской. При добавлении в такой раствор белков, имеющих на своих молекулах участки, способные связывать БФС, происходит связывание молекул красителя с белками. Это реакция сопровождается изменением соотношение между катионной и анионной формами БФС в пользу последней, имеющей синюю окраску. Изменение цвета раствора зависит от количества добавленного в среду белка. Альбумин является единственным белком мочи, способным связывать БФС при значениях рН от 5 до 7 единиц. Образование комплекса белок-БФС с другими белками (глобулинами или белком Бенс-Джонса) становится возможным только при снижении рН буферного раствора до 3,0 или ниже, как при количественных, так и при качественных способах его определения
[Bowie, et al., 1977]. Однако даже при таких низких значениях рН чувствительность метода остается значительно более высокой для альбумина, чем для других белков.Описано несколько его модификаций, отличающихся соотношением объёма исследуемой пробы и реакционной среды, типом буферного раствора [Карягина и соавт., 19
96; Schosinsky, et al., 1987]. В целом, данный метод обладает достаточно высокой специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью. В то же время некоторые авторы не считают его полностью свободным от влияния таких компонентов мочи, как мочевая кислота и креатинин [Jung & Niskel, 1989]. Их удаление гельфильтрацией на Сефадексе G-50 повышает чувствительность метода до 3 мг/л [Jung, et al., 1990].Перечисленные выше методы выполнимы только в лабораторных условиях. Наряду с ними существуют и такие методы обнаружения белка в моче, которые могут применяться практикующим врачом при непосредственном исследовании больного. При этом используются так называемых диагностические (индикаторные, реагентные, тестовые) полоски, позволяющие быстро провести полуколичественную оценку содержания белка в моче. Исследование химического состава мочи с помощью диагностических полосок
(dipstick methodology) представляет собой аналитическую процедуру, основанную на технологических приемах “сухой химии” (dry chemistry) [Voswinkel P., 1994]. При данном способе анализа все необходимые для конкретной реакции компоненты — буферный раствор, индикатор, ферменты, субстрат и др. — в фабричных условиях наносятся на бумажную или пленочную основу. Растворение реактивов и запуск необходимых химических реакций происходит при контакте полоски с мочой. Оценка результатов анализа проводится путём визуального сравнения окраски реагентного участка полоски с окраской прилагаемой калибровочной шкалы. Выпускаемые в настоящее время различными зарубежными фирмами (LaChema, Boechringer, Ames, Behrmg и др.) диагностические полоски (Гептафан, Multistix, Chemstrip, Rapignost, Combur-Test) позволяют в течение нескольких десятков секунд осуществить полуколичественную оценку исследуемого образца мочи не только в отношении белка, но и ряда других параметров: глюкозы, рН, билирубина и др. Применение прибора, работающего на принципе отражательной фотометрии, позволяет использовать полоски как для полуколичественной, так и количественной оценки результатов.Первые попытки создания диагностических полосок были предприняты в конце XIX столетия в Англии и Германии. К началу XX столетия стали применяться полоски для определения альбумина и глюкозы в моче. К середине 40-х годов были разработаны готовые формы для определения методами “сухой химии” уже 8 компонентов мочи
(Albucit, Saccharcit, Sangucit и др.). Основным недостатком первых поколений диагностических полосок была их низкая чувствительность, обусловленная использованием классических химических реакций, применявшихся в лабораторных условиях. Новая эпоха в использовании технологии “сухой химии” и реагентных полосок наступила в 1956 г., когда практически одновременно две компании — Lilly и Ames — применили глюкозооксидазную реакцию для определения глюкозы в моче. После того, как фирма Ames впервые использовала для определения белка в моче индикатор бромфеноловый синий и цитратный буфер, диагностические полоски получили широкое распространение для оценки выраженности протеинурии. По интенсивности сине-зеленой окраски реакционной зоны, развивающейся после кратковременного контакта полоски с мочой, содержащей белок, оказалось возможным судить о содержании белка в моче. Основной предпосылкой получения надежных данных при работе с индикаторными полосками является поддержание стабильного рН, обеспечивающее связывание белком индикатора в стандартных условиях, необходимых для получения воспроизводимых результатов. При длительном контакте полоски (большем, чем указано в инструкции) с мочой, особенно при исследовании образца мочи с высоким значением рН, емкость буферного раствора может оказаться недостаточной для поддержания исходного значения рН в реакционной зоне, что приведет к ложноположителъному результату. Так как в диагностических полосках в качестве индикатора чаще всего используется БФС, то они оказываются более чувствительными к альбумину, чем к другим белкам. В связи с этим полоски в большей мере приспособлены к обнаружения клубочковой протеинурии, особенно селективной. При оценке клубочковой неселективной протеинурии (а также канальцевой) результаты исследования оказываются ниже её реального уровня. Ещё в меньшей степени реагентные полоски приспособлены для обнаружения протеинурии, обусловленной выделением белка Бене-Джонса. В связи с тем, что при использовании диагностических полосок оценка результатов производится визуально, полученные данные следует рассматривать как сугубо ориентировочные. В связи с этим их использование следует ограничить скрининговыми процедурами, они удобны для быстрой оценки протеинурии непосредственно у постели больного. Кроме того, диагностические полоски оказываются полезными для определения степени необходимого концентрирования мочи перед её элекгрофоретическим исследованием, а также для контроля за разведением мочи при постановке количественных методов.Для оценки результатов, получаемых при использовании диагностических полосок, фирмы-изготовители предлагают следующие подходы:
1. Использование балльной оценки:
“trace” (следы), “+1”, “+2”, “+3”, “+4”; либо: “negative”, “trace”, “normal”, “positive”.2. Сочетание балльной оценки и результатов полуколичественного анализа, например:
“Negative”, 30 mg/dl (0,3 г/л), 100 mg/dl (l r/л), 500 mg/dl (5 г/л).Следует учитывать, что полученный в ходе исследования отрицательный результат
(“negative”) вовсе не означает полное отсутствие белка в пробе, так как большинство выпускаемых в настоящее время диагностических полосок не обладают способностью улавливать белок в моче в концентрации ниже, чем 150 мг/л.Несмотря на полуколичественный характер результатов, получаемых с помощью индикаторных полосок, для получения надежных и воспроизводимых данных при исследовании мочи с их помощью следует руководствоваться следующими несложными рекомендациями:
Рекомендации по работе с индикаторными полосками:
1. Перед работой с индикаторными полосками подробно знакомятся с содержанием приложенной к ним инструкции.
2. Для исследования используют свежевыделенную мочу, собранную в чистую и сухую емкость без консервантов.
3. Не используют полоски с просроченным сроком годности и не смешивают полоски различных партий. Извлеченные из контейнера и неиспользованные для анализа полоски не следует смешивать с полосками, хранимыми в контейнере. Контейнеры с индикаторными полосками хранят в прохладном, защищенном от влаги и света месте (не в холодильнике). Изменение первичной окраски индикаторых зон полоски может свидетельствовать об их непригодности.
4. После извлечения полоски из контейнера его следует герметично закрыть крышкой, оберегая содержимое от попадания внутрь влаги. Нельзя касаться рукой поверхности реакционной зоны полоски.
5. При проведёнии анализа полоску погружают в исследуемый образец мочи, смачивают все реакционные зоны и быстро извлекают, препятствуя вымыванию реактивов из реакционных зон
.6. Для удаления избытка мочи при извлечении полоски проводят её гранью по краю емкости с исследуемой мочой.
7. После извлечения полоски из исследуемого образца её располагают на горизонтальной поверхности, предотвращая смешивание реактивов из соседних реакционных зон.
8. При проведёнии анализа четко контролируют указанное в инструкции время, необходимое для развития окраски.
9. При оценке результатов совмещают на близком расстоянии реакционную зону полоски и соответствующую ей по окраске зону шкалы.
1
0. Сравнение окраски реакционной зоны и шкалы проводят при хорошем естественном освещении рабочей поверхности, не рекомендуется использование для этой цели прямого солнечного или искусственного освещения.11. Проверяют правильность и воспроизводимость метода при использовании каждой новой партии полосок на контрольном материале, содержащем и не содержащем исследуемые компоненты.
Результаты количественного определения содержания белка в разовой порции мочи зависят от её количества и степени разведения, в связи с чем результаты определения белка в однократно собранной порции мочи могут не совпадать с результатами, полученными при исследовании мочи, собранной за 24 часа. Полагают, что введение поправки на величину осмолярности мочи (отношение белок/осмолярность), либо пересчет на содержание креатинина (отношение белок/креатинин) позволяет приблизить результаты определения белка в однократно собранной порции мочи к результатам определения белка, в суточной моче
[Leman & Doumas, 1987; Larson, 1994].В последние годы много внимания уделяется проблеме выявления малых количеств альбумина в моче, так называемой микроалъбуминурии
(microalbuminuria, slight albummuria, pauci-albuminuria). К последней относят выделение альбумина с мочой в таком количестве, которое превышает физиологический уровень его экскреции, но находится за пределами чувствительности индикаторных полосок. Клиническое значение микроальбуминурии заключается в первую очередь в том, что её обнаружение у больных сахарным диабетом является наиболее ранним и достоверным признаком развития диабетического гломерулосклероза [Watts, 1991].Принято считать, что с мочой здоровый человек за сутки выделяет менее 30 мг альбумина [Larson, 1994]. К микроальбуминурии принято относить те случаи, когда с мочой за 24 часа теряется от 30 мг (<20 мкг/мин) до 300 мг альбумина (200 мкг/мин).
Задача количественной оценки микроальбуминурии в настоящее время решена. Большинство из известных методов основаны на иммуно-логической реакции между альбумином и антителами к нему. Это радио-иммунологический анализ
(RIA), иммуноферментный анализ (ИФА), радиальная иммунодиффузия. иммунотурбидиметрия [Watts G., 1986]. Недавно был предложен новый вариант иммуноферментного метода определения альбумина в моче, в котором вместо антител к данному белку использован высокоспецифичный рецептор к альбумину, представляющий собой белок стрептококка группы G [Гупалова Т.В. и соавт., 1996]. Все эти методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью, выбор конкретного из них определяется, в конечном итоге, аналитическими и, в большей степени, финансовыми возможностями лаборатории. Широкому распространению количественных методов оценки выраженности альбуминурии препятствует их высокая стоимость.Попытку снижения затрат путём использования более дешевых и простых в обращении аналитических форм представляют собой полуколичественные методы обнаружения микроальбуминурии с применением реагентных полосок. Основу такого подхода, как и в количественных методах, составляют распознающие альбумин иммунохимические реакции, компоненты которых располагают в реакционной зоне диагностических полосок. В частности, фирмой
Boechrmger Mannheim были разработаны и предложены для широкого использования диагностические полоски, обеспечивающие обнаружение небольших количеств альбумина в моче. При определении альбумина полосками Micral-Test в микрообъемах жидкости обеспечиваются оптимальные условия для последовательного протекания следующих реакций:1. Иммунохимической — между молекулами альбумина исследуемого образца мочи и антителами к нему, конъюгированными с ферментом (3-галактозидазой
2. Хроматографической, предназначенной для выведения из реакции избытка комплекса антитела к альбумину-бета-галактозидаза путём его связывания с иммобилизированным альбумином.
3. Ферментативной, катализируемой бета-галактозидазой, приводящей к расщеплению субстрата и образованию окрашенного продукта реакции — красителя хлорфенолового-красного.
Сравнение окраски индикаторной зоны полоски с цветной шкалой позволяет оценить содержание альбумина в моче в пределах от 0 до 100 мг/л с интервалами 10, 20, 50 и 100 мг/л. Специфичность метода оценивается в 97%, чувствительность — 86% [Козырева ЕА, 1994]. Обязательным условием при использовании данных диагностических полосок является точное соблюдение временных интервалов, указанных изготовителем. Уменьшение времени контакта полоски с мочой или времени инкубации приводит к ложноотрицательным результатам
[Marshall, et al., 1992].При выборе метода количественного определения белка в моче врач-лаборант должен руководствоваться следующими соображениями.
Во-первых, величиной затрат на выполнение самого исследования с учётом стоимости реактивов, оборудования, времени, необходимого для его выполнения, и квалификации персонала лаборатории. Во-вторых, аналитическими характеристиками метода, включающими аналитическую надежность, устойчивость к действию экзогенных веществ, колебаниям состава мочи, присутствию в ней посторонних соединений.
Если исключить из обсуждения “стоимостный” аспект проблемы, то ни один из рассмотренных методов из группы турбидиметрических и связывания с красителем не обладает решающими преимуществами при сравнении с другими; все они выполняются достаточно быстро при небольшом количестве операций, не требуют высокой квалификации исполнителей. При этом все упомянутые методы, исключая метод, использующий
Ponso S, оказываются весьма чувствительными к изменению белкового состава мочи, “лучше” определяют альбумин, чем глобу-лины и “нед о открывают” парапротеины. Судя по литературным данным [Chambers R.E., et al., 1989], преципитационные методы количественного определения белка в моче плохо поддаются стандартизации, часто приводят к получению ошибочных результатов, что снижает их ценность для клиники. Несмотря на это, эти методы в настоящее время широко используются в лабораториях из-за невысокой стоимости и доступности реактивов.Достаточная чувствительность, хорошая воспроизводимость и простота выполнения делают перспективными методы определения белка по связыванию красителей, однако высокая стоимость реактивов препятствует их широкому использованию в лабораториях. С точки зрения исполнителя в повседневной работе лаборатории при большом потоке исследований биуретовый метод является неудобным из-за большого числа операций. В то же время он характеризуется высокой аналитической надежностью, позволяет определять белок в широком диапазоне концентраций и выявлять альбумин, глобулины и парапротеины со сравнимой чувствительностью. Поэтому биуретовый метод рассматривают в качестве референтного и рекомендуют для сравнения других аналитических методов оценки протеинурии
[Dilena D., et al, 1983]. По нашему мнению, в лабораториях, обслуживающих нефрологические отделения, должен выполняться именно биуретовый метод определения белка в моче, в том числе и для определения величины суточной потери белка с мочой.Определенные успехи достигнуты в автоматизации количественных методов определения состава мочи, в том числе и содержания белка. По мнению ряда авторов, автоматизация методов определения белка способствует существенному повышению качества исследований
[Watanabe N., et al, 19 86]. В то же время следует помнить, что процесс адаптации метода к анализатору не затрагивает физико-химические основы метода, поэтому в нем практически полностью сохраняются особенности и недостатки, присущие исходному ручному варианту.Литература